Part 1.纳米制剂表征
1.1纳米颗粒的形态学表征PMID:32554031、31465938
采用扫描/透射电子显微镜(SEM/TEM)观察纳米凝胶的形貌。
1.2纳米颗粒的化学表征PMID:32554031、31465938
1.3包封率和负载力(①客户PPT提供方案,②PMID:32545473,两选一)
①测定A-DiR 在纳米颗粒中的包封率:收集上清液,10,000 g离心40 分钟后,适当稀释,用发光光谱仪测定DiR的含量。如下所示计算药物包封效率和负载能力:
②紫外可见分光光度计用于评估聚合物纳米颗粒中包裹的药物量。
1.4体外释放PMID:33657949、32545473
将透析袋中体积为10 mL的制剂加入50 mL PBS溶液中,该溶液在振荡水浴中保持在37 ℃,用于估计药物释放。在0.25至48小时(释放时长需根据制剂进行调整)确定时间间隔后取出2 mL PBS 溶液,并通过紫外-可见分光光度计在408 nm波长下进行分析。
1.5血凝试验
采用血细胞凝集试验证实OL在纳米颗粒表面的生物活性。OL-ANP和ANP与大鼠的1% (v/v) 新鲜红细胞悬液在37°C下孵育30 分钟。在显微镜下观察悬浮液。
1.6稳定性PMI:28865359
Part 2.体外研究
2.1细胞毒性PMID:33307160、28865359
两种人细胞系用于生存能力研究:人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)和人鼻中隔细胞系(RPMI-2650)。
SH-SY5Y细胞系在含有0.04M碳酸氢钠DMEM培养基中培养。RPMI-2650细胞系在EMEM培养基中培养,添加Earle盐和碳酸氢钠,添加2mm谷氨酰胺和1%非必需氨基酸。两种细胞培养基中均添加了10% FBS和1%的青霉素-链霉素混合物。细胞使用0.25%胰蛋白酶-edta溶液每周传代2-3次,在37 ℃、5% CO2和95%相对湿度下培养。
孵育过夜(40-50%的一致性),1.37至3,000 μg/ml的ANP和OL-ANP悬浮液以及浓度为0.152至333μg/ml的OL溶液在含有20% FBS 的DMEM 中在37°C 下培养4 小时。以5% DMSO为阳性对照,阴性对照为无处理对照。孵育24和48h后,CCK-8测定各组细胞活力。
(分组:阴性对照组、不同浓度ANP和OL-ANP组(至少5个浓度)、阳性对照组)
2.2黏膜粘附体外评估PMID:29240797、31920290、31266990、32168767(几种不同方法)
使用改良的平衡技术,使用两个玻璃瓶和羊鼻粘膜。从羊鼻腔的嗅觉区域切下厚度为0.6 mm、表面积为2.835 cm2的鼻粘膜,并立即用线将粘膜侧朝外固定到每个玻璃瓶上。小瓶在32–34℃下储存10分钟。将一个小瓶连接到天平的一侧,并将0.5 ml凝胶样品放置在连接到小瓶底部的两个粘膜之间。测量了破坏粘膜粘附所需的最小水重量。
粘粘附强度(dynes/cm2)=mg/A
注:其中m为脱离所需的重量,g为重力引起的加速度(980cm/s2),A为黏膜暴露的表面积(cm2)。
(分组:空白对照组、ANP组、OL-ANP组)
2.3渗透传输研究PMID:34925013、31465938、28865359、31920290
RPMI 2650细胞以2×105个细胞/孔的密度接种在12孔Transwell上室小孔(1.12 cm2,0.4μm孔径)中。试验在接种23天后进行,接种4天后从细胞层顶端(AP)取出培养基,在气液界面诱导上皮分化。每周更换三次来自基底外侧(BL)隔室(0.5 ml)的培养基。用Evom®STX2电压表监测极化细胞多层膜的跨上皮电阻(TEER),以评估膜的完整性。TEER值高于50 Ω cm2可用于渗透分析。从顶端到基底外侧(AP-BL)的运输研究进行。去除培养基并用含10 mM HEPES(pH 7.4)的Hanks平衡盐溶液(HBSS)替换。在37 ℃下摇动(45 rpm)稳定后,向AP侧(0.5 ml)添加治疗溶液(ANP、OL-ANP制剂)。孵育30、60、90、120和180分钟后,从BL侧(1.5 ml)取出等分试样(240μl)。使用HPLC检测试样中药物浓度。
注:式中,dQ/dt为渗透速率;A是膜的表面积(单位:cm2);c0是AP室中的初始药物浓度。
注:式中,C f是供体或受体(CRf)室中的最终化合物浓度;c0是供体室中的初始浓度;Vd和Vr分别是供体和受体室的体积。
(分组:空白对照组、ANP组、OL-ANP组)
Part 3.体内研究
3.1黏膜毒性(客户PPT提供方案)
使用聚乙烯10(PE 10)管连接到各组(n = 3)的鼻孔中,依次给予ANP、OL-ANP(25 mg/ml)或生理盐水10μl持续一周。微升注射器。末次给药后24小时处死大鼠,取鼻黏膜。对鼻黏膜的石蜡切片(5 μm厚)进行免疫组织化学染色,用于神经元特异性烯醇化酶(NSE)检查。切片用兔抗神经特异性烯醇化酶多克隆抗体孵育,用SABC试剂盒进行,最后用DAB染色。使用显微镜获得切片图像。
(分组:空白对照组、ANP组、OL-ANP组)
3.2体内分布(活体成像)PMID: 32554031
采用荧光成像技术研究DIR标记的ANP及OL-ANP在大鼠体内的分布。采用罗丹明B制备DIR标记的ANP及OL-ANP纳米制剂。实验前,体重220-240g的雄性小鼠大鼠禁食12h,自由饮水。大鼠经鼻内给药ANP及OL-ANP纳米制剂(剂量)。采用CRI荧光成像系统(2、5、30、60、120、240、480、720min)观察大鼠ANP及OL-ANP纳米制剂在脑、肺、肝和肾中的分布。
(分组:空白对照、鼻内给予ANP/DiR组、鼻内给予OL-ANP/DiR组)
3.3药代动力学研究(HPLC)PMID:32610539、34925013
在Wistar大鼠采用鼻内给予ANP和OL-ANP及静脉滴注两性霉素B,以指定的时间间隔收集血液样本。每个时间间隔处死每组六只大鼠,取出后用生理盐水清洗整个脑,然后称重。用磷酸盐缓冲液(pH 7.4)在5000rpm下匀浆脑组织3分钟。使用HPLC检测试样中药物浓度。
(分组:空白对照、鼻内给予ANP组、鼻内给予OL-ANP组、静脉注射两性霉素B组)
3.4药效学研究PMID:33657949、34189154、28320715、客户PPT提供方案
通过检测脑脊液中隐球菌数、乳胶凝集试验(LAT)和病理组织切片来评价疗效。大鼠模型:菌株H99(血清型A)从-80 °C恢复。制备浓度为2×108CFU/mL的菌悬液,将50 uL菌悬液注入颅内,建立隐球菌脑膜炎大鼠模型。注射前取相同体积的脑脊液以维持颅内压。所有大鼠被分成四个随机组(每组10只大鼠)。第1组为假手术组,其余三组均建立隐球菌脑膜炎大鼠模型。接种后第7天,第3组和第4组分别鼻内给予ANP和OL-ANP(给药浓度待确认),第1组假手术组和第2组模型组不干预。在第14天和第21天,取100ul脑脊液(CSF)进行CSF培养并进行LAT以比较治疗效果,并在治疗后的最后一天处死各组大鼠,并取各组大鼠进行病理组织切片。
乳胶凝集试验(LAT):使用涂有抗CrAg抗体的乳胶颗粒。CSF样品分别用热处理或用链霉蛋白酶溶液孵育。将样品与隐球菌乳胶混合,并读取结果。将显示颗粒或团块的样本与制造商的阳性对照进行比较,并评估样本的阳性率。PMID: 34189154
病理组织切片:收集大脑并放入10%中性缓冲福尔马林中进行组织病理学评估。对福尔马林固定的组织进行修剪,通过蔗糖替代物进行冷冻保护,然后嵌入OCT冷冻培养基中。制备约5 μm切片用于染色。用市售的针对新型隐球菌的小鼠单克隆抗体用于确定感染程度(MyBioSource,LLC,San Diego,CA)。PMID: 28320715
(分组:假手术组、模型组、ANP组、OL-ANP组)