高通量测序在病原微生物学方面的研究进展

近年来，随着测序技术的不断发展，实现对大量分离菌高通量，更准确的序列分析，以及对细菌种群进行高分辨率的系统发育分析，极大地提高了对病原微生物产生、适应和传播的认识。高通量测序（high throughput generation sequencing，HTS）技术是人类和动物基因组学研究领域中最热门的话题，与基于Sanger方法的最复杂的毛细管测序仪相比，该技术可以产生的数据多100倍。

与传统的第一代测序，又称Sanger测序相比，在DNA测序方面，HTS技术具有快速、廉价和高通量的优点，使得细菌基因组学研究发生了巨大的变化。高通量“台式”测序仪的出现的使实验室能够独立于专业测序中心进行测序工作，同时，HTS高分辨率的特点可以确定病原菌克隆的分子机制，辅助研究人员推断出全球大流行以及局部暴发期间的传播途径，甚至可以对患者个体在感染期间进行细菌种群进化分析。与传统的杂交方法相比，HTS还提供了转录组分析的潜力，包括覆盖全基因组范围及准确定量等，且深度测序辅助对细菌突变体文库的构建，以确定病原菌在体内生长或在其他特定生长条件下存活所需的决定因素。本文将对HTS在细菌病原体方面的近期研究进展进行阐述。

一、感染过程中细菌进化的研究

感染性疾病的进展和结果往往取决于宿主与病原体如何相互作用，采用HTS技术进行的研究为定殖和感染过程中细菌病原体的进化提供了新的见解。例如，研究发现，在感染过程中，由于选择性压力（例如与其他微生物共同感染、宿主的免疫反应及抗生素的应用等），某些固定的亚种中会随机出现有利与病原菌的突变，同时，在感染期间还可以发生抗生素耐药性的突变。相较于与传统的PCR扩增技术和一代Sanger测序，HTS的超基因组学方法可以从微生物群分析得到更大的多样性。例如，与健康者相比，肺囊性纤维化患者的微生物多样性降低与更严重的炎症相关，并且微生物的代谢途径的明显发生改变。

二、确定疾病暴发的来源和传播途径

传统的细菌分型方法鉴别力较低，无法在传染病暴发的流行病学调查中发挥精准的作用。全基因组序列可以为分离株之间核苷酸提供最高水平的分辨率，可识别医院内部和医院之间以及社区之间的传播。应用该种新方法可以确定传播的起源是某单一菌株还是多个菌株共同引起。

三、有助于了解病原性克隆出现的分子基础

对大量紧密相关的分离菌株进行测序可帮助我们重建高分辨率的系统发育树，有助于对病原菌克隆株出现和传播的潜在过程进行深入了解。例如，基于HTS的进化研究，证明了第七次霍乱大流行由三个独立事件组成，后两个是由于霍乱弧菌获取复方新诺明抗生素耐药元件造成的，这导致了对常用霍乱治疗的失败引发了流行。

四、HTS在了解病原体生物学方面的未来应用

测序技术的飞快发展，单分子测序、读长不断的增加使得微生物群落内单个病原体的高

精度组装成为了可能。目前细菌培养依然是全基因组测序必不可少的前提条件步骤，但目前已研发出可不经过培养直接检测标本中微生物的新型方法。这些应用在明确病因不明的感染性疾病中价值巨大。此外，跳过培养的环节，大大节省了样本周转时间。

综上所述，测序技术的发展彻底改变了我们对感染性疾病的研究方式。这种新的技术方法可使人们更加了解微生物病原体的生物学，从而改善感染的情况及最终治愈感染性疾病。