多发性硬化症(MS)

多发性硬化症(MS)

标准的EAE可能不是研究髓鞘再生与轴突完整性的可能关系的理想模型然而，由于炎性脱髓鞘与多发性硬化症高度相关，我们决定寻求一种方法，使免疫反应和退变过程与少突胶质细胞的修复作用脱钩。

多发性硬化症的脱髓鞘破坏了神经信号，并导致轴突退化。虽然重新髓鞘修复有望恢复丧失的功能，但目前尚不清楚重新髓鞘修复是否能防止轴突丢失。在实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)小鼠模型中，炎性脱髓鞘伴随着显著的神经元丢失，而在该模型中重新髓鞘形成的证据是持续的炎症、变性和可能的重新髓鞘形成。要证明重新髓鞘形成的功能意义，就必须有选择地改变与炎症和退变相关的重新髓鞘形成的时间。我们通过直接谱系分析和假设新形成的髓鞘在炎症高峰期保持稳定，证明了EAE诱导后加速了髓鞘再髓鞘形成，部分原因是未成熟髓鞘中没有MOG的表达。M1受体是少突胶质细胞分化和髓鞘形成的有力负调控因子，其特异性基因消融可加速髓鞘再生，防止轴突丢失，改善功能恢复。综上所述，我们的研究结果表明，炎性脱髓鞘后加速的髓鞘再生支持轴突的完整性和神经元的功能。

多发性硬化症(MS)的脱髓鞘是以中枢神经系统(CNS)髓鞘为靶点的异常免疫反应所致(Franklin，2002)。在疾病过程中，脱髓鞘轴突经历不可逆转的退化，这与疾病的进展相关，并导致永久性残疾-这些事件是进行性多发性硬化症的病理特征。到目前为止，还没有直接预防神经元变性的治疗干预措施，特别是在变性的确切机制仍不确定的情况下(Bjartmar和Trapp，2003年；Simons等人，2014年)。作为功能性神经纤维单位的重要附件，髓鞘提供了多层同心膜，以最大限度地提高动作电位的速度和降低能量需求。髓鞘在发育中的中枢神经系统中的重要性被最近的发现进一步说明，这些发现表明少突胶质细胞为神经元提供关键的代谢支持(Fu¨nfschilling等人，2012；Lappe-Siefke等人，2003；Lee等人，2012)。然而，尽管在MS这样的炎症性条件下，髓鞘再分化似乎在保护轴突完整性和恢复神经元功能方面起着至关重要的作用，但缺乏直接的证据。多发性硬化症的再髓鞘形成是一个低效的过程，这可能是由于抑制的微环境阻止少突胶质前体细胞(OPC)终末分化为有髓鞘的少突胶质细胞(Chang等人，2002；Huang和Franklin，2011；Kuhlmann等人，2008；Wolswjk，1998)。此外，人们认为微环境还可能改变OPC的表观遗传调控，以改变发育过程中和脱髓鞘后分化所需的转录程序(Liu等人，2016a，2016b；Moyon等人，2016；Huynh等人，2014)。为了促进多发性硬化症的髓鞘修复，最近的高通量筛选工作已经确定了一些髓鞘再生化合物(Deshmukh等人，2013年；Mei等人，2014年；Najm等人，2015年；Samanta等人，2015年)。有趣的是，其中一些化合物促进了少突胶质细胞的早熟分化，并减轻了炎性脱髓鞘动物模型EAE的临床症状(Liu等人，2016b；Mei等人，2016；Deshmukh等人，2013年；Najm等人，2015；Samanta等人，2015)。这一现象背后的机制尚不清楚，因为活跃的炎症动态地导致同时发生的脱髓鞘、轴突变性和再髓鞘形成(Miller和Karpus，2007；Nikicét al.，2011；Ransohoff，2012；Stanley和Pender，1991)。要证明髓鞘再生的功能意义，就必须将免疫反应和退变过程从少突胶质细胞介导的修复中分离出来。在这里，我们通过基因靶向OPC中M1 M受体(Chrm1)的细胞特异性缺失，将重新髓鞘形成与炎症和变性分离，以证明加速的重新髓鞘形成足以降低EAE临床评分的严重性，部分归因于保护轴突的完整性。

EAE的脱髓鞘、轴突丢失和再髓鞘形成

为了确定EAE是否适合研究再髓鞘形成和轴突保护，我们对整个EAE过程中脱髓鞘的时间、轴突丢失和重新髓鞘形成的可能性进行了表征。我们使用MOG肽(MOG35-55)在C57BL/6遗传背景的小鼠中诱导EAE(Mendel等人，1995年)。小鼠在免疫后14天左右出现慢性瘫痪，并达到最高临床评分，一直持续到免疫后30天。为了描述EAE过程中脊髓脱髓鞘的特征，我们采用了四氧化三铯(OsO4，一种能有效染色髓鞘的亲脂过渡金属)来检查脊髓白质束上髓鞘的完整性(图1a-c)。在EAE严重程度高峰时，在腰椎脊髓白质束检测到脱髓鞘病变(图1b)，随后在EAE晚期检测到广泛的全局性脱髓鞘病变(图1c)。脊髓横断面上的一种髓鞘特异性蛋白MOG的免疫染色也显示了广泛的髓鞘损伤(图1d-f)。值得注意的是，神经丝(NF)染色显示临床严重程度高峰时有大量脱髓鞘轴突(MOG阴性区域)(图1e)，在EAE晚期NF免疫反应显著丧失轴突，表明神经元显著变性(图1f)。透射电镜下(图1g-I)，EAE脊髓晚期稀疏见有髓鞘轴突，伴有大量脱髓鞘和可能变性的轴突，胞浆弥漫染色(图1h，i)。这些结果表明，EAE模型存在明显的炎症、脱髓鞘、轴突变性和稀疏的再髓鞘形成。这些发现表明，标准的EAE可能不是研究EAE的理想模型。再生髓鞘形成与轴突完整性之间可能存在联系。然而，由于炎性脱髓鞘与多发性硬化症高度相关，我们决定寻求一种方法，使免疫反应和退变过程与少突胶质细胞的修复作用脱钩。

小分子方法不能明确显示EAE的再髓鞘形成

为了测试氯马汀对MOG诱导的EAE的疗效，从免疫开始(PI0D)开始每天口服氯马汀。氯马斯汀的预防性治疗显著降低了EAE在疾病高峰期和整个慢性期的临床严重程度(图2a)。髓鞘再生和轴突丢失通过荧光髓鞘检测和腰髓NF免疫组织化学染色进行评估(图2b，c)。氯马斯汀治疗显著地保留了髓鞘染色强度，并防止了轴突丢失，这是通过EAE晚期白质束中NF免疫染色来评估的(图2b，c)。为了检测T细胞、巨噬细胞的浸润和小胶质细胞的激活，我们对CD3(T细胞)和Iba1(巨噬细胞和小胶质细胞)进行了免疫染色，并对EAE晚期脱髓鞘病变中这些细胞的密度进行了定量(图2d)。经氯马斯汀治疗后，CD3或IBA1阳性细胞密度未见统计学差异，提示其作用机制不改变细胞浸润水平的炎症反应(图2E)。然而，由于组织学提供了一个时间点的静态图像，不可能最终确定氯马斯汀或任何其他小分子是否通过单独促进髓鞘再生成而导致EAE临床评分的减弱。话虽如此，氯马斯汀仍然有可能调节炎症的其他方面，提供某种轴突支持，甚至稳定髓鞘，从而防止进一步的损害。同样重要的是要注意，所有这些潜在的影响并不是相互排斥的，它们都可能导致临床评分的减弱。

为了确定在EAE模型中氯马斯汀是否显著加速了再髓鞘形成，我们利用一种遗传学方法，通过使用Cspg4-CreErt；MAPT-mGFP系在EAE中检测了新的髓鞘生成(再髓鞘形成)(图3a)(Hippenmeyer等人，2005年；Young等人，2013年；Etxeberria等人，2016年)。在这一系中，重组只在NG2细胞(OPC)中被他莫昔芬诱导，新形成的髓鞘(重新髓鞘形成)可以通过膜相关的GFP亚型(MGFP)的表达而被观察到，因为只有成熟的少突胶质细胞表达tau(图3a)。我们在免疫和氯马斯汀治疗前两天用单剂量他莫昔芬诱导重组。在疾病高峰期，携带GFP的EAE小鼠中没有GFP阳性的髓鞘(图3-数字补充1a)，而在氯马斯汀治疗后，许多GFP阳性的髓鞘可见为围绕脱髓鞘轴突(NF+/MOG-)的“环”(图3b)。这些结果直接表明，新形成的髓鞘(有髓鞘轴突)可以在疾病的高峰时期通过髓鞘再生化合物被启动和鉴定。然而，如果重新髓鞘形成发生在炎症的高峰期，新的髓鞘是如何在这种剧毒的环境中稳定下来的？我们推测，在MOG诱导的EAE模型中，随着重新髓鞘形成的加速，新的髓鞘还不表达MOG抗原，并将被排除在MOG诱导的炎性脱髓鞘之外。这一点在检测到一些被薄的绿色荧光蛋白膜包围的轴突时很明显，这些轴突的MOG表达仍为阴性(图3c)。我们还检测了NG2-CreErt；tau-mGFP小鼠的重组效率，因为我们在赋形剂对照组小鼠中没有检测到任何GFP阳性的髓鞘。由于新形成的少突胶质细胞在成年小鼠中不能高频率产生，我们检测了14日龄小鼠的重组效率，方法是在出生后第8天给药他莫昔芬，6天后检测重组情况。通过检查出生后第14天髓鞘稀疏的皮质区域，我们量化了GFP阳性、CC1阳性的少突胶质细胞的数量，并计算出重组效率约为少突胶质细胞总数的30%(图3-图补充1b)。同样值得注意的是，我们没有发现皮质中非CC1阳性的GFP阳性细胞，这表明GFP的表达是少突胶质细胞所特有的。

因此，虽然我们可以使用这种方法来识别EAE中新生成的少突胶质细胞和重新髓鞘形成，但它不一定允许我们识别所有重新髓鞘轴突。尽管髓鞘再分化与临床评分的降低是一致的，但目前尚不清楚轴突完整性的保持是否仅仅是由于髓鞘再分化所致，因为没有一种小分子是细胞类型特异性的，靶外效应可能有助于EAE临床评分的降低。Clemastine可能通过拮抗免疫细胞表达的许多受体--包括组胺受体1和毒鼠强受体--来调节免疫系统(Jutel等人，2001年；Johansen等人，2011年)。因此，要将重新髓鞘形成与免疫反应和退化过程的影响分开，需要在不影响其他细胞类型的情况下对OPC进行细胞特异性操作。由于氯马斯汀已知具有抗毒扁豆碱的特性，并且在高通量筛选的一系列其他抗毒扁豆碱化合物中被鉴定出来(Mei等人，2014年)；识别并敲除OPC中的特定靶受体可以明显复制氯马斯汀的应用效果，并使我们能够明确地证明在EAE中髓鞘再分化的神经保护作用。

用于髓鞘再分化的毒鼠碱受体靶点的鉴定

确定氯马斯汀的靶受体可能为OPC的细胞特异性操作提供一个理想的策略。氯马斯汀和苯扎托品是两种有效的髓鞘再生化合物，它们作用于拮抗6个重叠的靶点，包括5个毒鼠碱乙酰胆碱受体亚型(Chrm1-Chrm5)和组胺受体1(HRH1)(Cohen和Almazan，1994；Cohen等人，1996年；de Angelis等人，2012年；Kubo等人，1987；Ragheb等人，2001年)。通过mRNA分析和抗体染色检测这些受体在少突胶质细胞上的表达。QRT-PCR和免疫染色检测到OPC在mRNA(图4-图形补充1a，b)和蛋白水平(图4-图形补充1c，d)中都有Chrm1-Chrm5和Hrh1的表达。由于所有潜在的受体靶点都由OPC表达，尽管表达水平各不相同，我们假设在功能丧失时，M受体(MR)拮抗剂对分化的影响应该被阻断。为了研究潜在的靶点，从Chrm1-Chrm5或HRH1基因敲除小鼠中系统地纯化了OPC。在使用氯马斯汀、苯扎托品或赋形剂治疗后，对MBP阳性的OPC和PDGFRA阳性的OPC的数量进行了量化(图4a)。治疗组归一化为载体对照组，以揭示MR拮抗剂对个别受体缺失引起的少突胶质细胞分化的影响。正如预期的那样，氯马斯汀或苯扎托品在野生型OPC中检测时，导致OPC数量增加约5倍，OPC数量同时减少(图4a)。MR拮抗剂在Chrm2-Chrm5或HRH1基因敲除OPC的培养中也观察到了类似的作用，这表明这些单独的受体都不是介导MR拮抗剂作用的关键(图4a)。有趣的是，Chrm1基因的敲除完全消除了抗毒扁豆碱化合物的作用，与载体处理的Chrm1KO细胞相比，导致了类似数量的OPC和分化的OL，这表明Chrm1可能是MR拮抗剂对少突胶质细胞影响的唯一中介(图4a)。为了确定Chrm1是否足以介导抗毒扁豆碱类药物的作用，我们研究了Chrm1缺失是否会复制毒扁豆碱拮抗剂对OPC分化和髓鞘形成的促进作用。Chrm2-Chrm5或HRH1基因敲除小鼠的OPC表现出与野生型OPC相似的分化(MBP阳性)和增殖(PDGFRA阳性)水平(图4b，c)。然而，与野生型培养相比，Chrm1基因敲除培养物显示MBP阳性的OL增加了五倍，OPC的数量显著减少，这与删除Chrm1足以促进OPC分化的假设是一致的(图4c)。

为了测试OPCs是否从Chrm1基因敲除小鼠表现出早熟分化和髓鞘形成，我们将Chrm1基因缺失的OPC与大鼠背根神经节(DRG)神经元进行共培养。我们检测到骨髓化骨髓化骨肉瘤的数量显著增加，同时骨髓化骨髓瘤细胞的数量也随之减少。结果表明，Chrm1在体外对少突胶质细胞的分化和髓鞘形成有很强的负调节作用。

删除Chrm1作为加速髓鞘再生动力学的一种方法

考虑到Chrm1基因缺失的OPC分化和髓化的内在能力增强(图4)，我们假设Chrm1基因敲除小鼠的再髓鞘形成动力学将会加速。为了验证这一假设，我们实施了溶血磷脂诱导的局灶性脱髓鞘模型。6周龄仔鼠脊髓背索和腹外侧白质束出现脱髓鞘现象(图5a)。在这个模型中，重新髓鞘形成是一个涉及OPC招募和分化的过程。根据我们之前的发现，OPC分化和再髓鞘形成发生在损伤后7-14天(DPL)(Fancy等人，2011年；Mei等人，2014年)。因此，我们通过原位杂交和免疫染色分析了在10DPL时少突胶质细胞的分化(图5b-e)。原位杂交显示，与野生型小鼠相比，Chrm1基因缺失小鼠皮损中Plp阳性的OL显著增加(图5b，d)。此外，病灶的Magin原位杂交(图5c)和MBP免疫染色(图5e)均显示Chrm1基因敲除小鼠在10DPI时OL分化增强。这些发现表明，Chrm1缺失的OPC在脱髓鞘后表现出增强的分化和加速的重新髓鞘形成的动力学。

为了确定Chrm1是否是炎性脱髓鞘后的潜在治疗靶点，我们用MOG35-55免疫诱导了性别匹配的Chrm1基因敲除和野生型窝产仔EAE。野生型MOG35-55EAE小鼠在8-14天内出现慢性瘫痪，无明显缓解期(图5f)。相比之下，Chrm1基因缺失的EAE小鼠在疾病的最初阶段表现出中度的疾病严重程度降低，随后是缓解期，临床评分从免疫后19天开始显著下降(图5f)。为了测试Chrm1缺失是否促进了EAE小鼠的再髓鞘形成并保护了轴突的完整性，用MOG免疫染色检测了髓鞘，用NF免疫染色检测了腰髓中的轴突(图5g，h)。与野生型EAE小鼠相比，Chrm1基因敲除小鼠的脱髓鞘面积减少(由MOG免疫反应性表示)，提示有重新髓鞘形成和轴突保存(图5i，j)。为了研究少突胶质细胞以外的细胞中Chrm1的缺失是否有助于防止轴突丢失，我们评估了脊髓中的无髓轴突，这些轴突暴露在与有髓轴突相似的炎症环境中。NAı‘ve野生型和Chrm1基因敲除小鼠脊髓背角内CGRP阳性的无髓轴突密度相近(图5k，l)。当遭受EAE时，Chrm1基因缺失和野生型小鼠的CGRP阳性纤维密度均显著降低(图5k，l)。值得注意的是，CGRP阳性纤维的减少在野生型和Chrm1基因敲除小鼠中相似，表明Chrm1基因缺失并不能挽救无髓轴突免于变性，提示加速的再髓鞘形成可能保护EAE后的轴突免于变性。虽然这些结果表明Chrm1是治疗EAE的潜在有效靶点，但我们不能完全排除全局敲除Chrm1可以减轻炎症或以其他方式直接保护轴突的可能性。因此，有必要在OPC中特异性地产生Chrm1的条件性缺失，因为这将允许我们从基因上调节EAE的再髓鞘形成，并将免疫反应和退化过程与少突胶质细胞介导的修复的影响分开。

加速髓鞘再生可防止EAE的轴突丢失

为了确定再生髓鞘是否足以防止炎性脱髓鞘后轴突的丢失，我们通过将Chrm1系与Cnp-Cre系杂交，在OPC中特异性地产生了条件性Chrm1基因敲除小鼠。我们最初检查了8周龄小鼠的少突胶质细胞发育和髓鞘形成情况，以确定Chrm1CKO小鼠是否会出现髓鞘异常。电镜观察显示，Chrm1CKO(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)小鼠与对照(Chrm1fl/fl)小鼠相比，轴突和髓鞘形态相似。我们测量了Chrm1cKO和产仔对照组有髓轴突的G比率(图6a)。在Chrm1cKO和对照组之间没有发现明显的差异(图6a)。MOG和NF免疫染色显示Chrm1CKO和对照脊髓的有髓纤维密度相当(图6b)。此外，分化的少突胶质细胞密度在Chrm1cKO和对照之间没有明显变化。

这些结果表明Chrm1 CKO小鼠成年后神经纤维发育正常(图6)。我们接下来诱导了性别匹配的Chrm1 CKO，Chrm1杂合子的EAE(CNP-Cre；Chrm1fl/+)和MOG35-55免疫控制窝产仔(图7a)。对照EAE小鼠在10-15天内出现慢性瘫痪，没有明显的缓解期(图7a)。相反，Chrm1CKO小鼠的疾病严重程度在早期(PI 13)和整个慢性期(图7a)都明显减轻。值得注意的是，Chrm1杂合子小鼠在早期疾病严重程度中度降低，随后进入缓解期，临床评分从免疫后22天开始显著下降(图7a)。这些结果表明，OPC中Chrm1基因的细胞特异性缺失足以减轻由EAE诱导引起的功能缺陷，并且由于杂合子和纯合子小鼠在EAE晚期导致相似的临床评分，因此Chrm1失活的这些效应可能是剂量依赖性的。(2)OPC细胞特异性的Chrm1基因缺失足以减轻EAE诱导引起的功能缺陷，并且这些效应可能是剂量依赖性的，因为杂合子和纯合子小鼠在EAE的晚期导致相似的临床评分。

为了研究这些影响是否是由于重新髓鞘形成和随后轴突完整性的保存，我们检查了甲苯胺蓝染色的EAE脊髓的半薄切片中的有髓轴突(图7b，c)。与对照组相比，Chrm1CKO EAE脊髓腹侧白质中的有髓轴突密度显著增加(图7c)。与对照组相比，在Chrm1CKO EAE脊髓中，MOG和NF的免疫染色显示MOG免疫反应面积和NF阳性轴突均显著增加(图7d-h)。为了确定重新髓鞘形成是否具有神经保护作用并保护Chrm1 CKO小鼠的轴突完整性，我们用电镜观察了脊髓腹侧白质中的轴突(图7i，j)。在NAı？ve小鼠中，与先前存在的髓鞘较厚的有髓轴突相比，EAE脊髓中的有髓轴突是通过较薄的髓鞘来识别的(图7I)。在对照组EAE小鼠中，很容易检测到脱髓鞘和退化的轴突，其中有一些预先存在的有髓轴突，只有几个重新髓鞘轴突。相反，在Chrm1CKO EAE脊髓中观察到的有髓鞘轴突更为一致(图7J)。接下来，我们量化了EAE脊髓中轴突的比值，重点放在腹侧白质上(图7k)。在Chrm1 CKO EAE脊髓中，无髓鞘轴突的百分比(g比率=1)减少，表明Chrm1 CKO EAE小鼠的再髓鞘形成增强(图7k)。与Chrm1CKO小鼠相比，EAE对照组小鼠的总有髓轴突密度(每mm2)显著降低，这表明Chrm1CKO EAE小鼠经历的轴突变性较少(图71)。为了确定重新髓鞘形成是否是提高轴突存活率的直接原因，我们通过检查G-Ratio对预先存在的有髓轴突中的重新髓鞘轴突进行了分类。我们推测，面积比大于0.8的轴突很可能是有髓轴突(图7k)，因为NAı‘ve脊髓白质中的大多数轴突都表现为低于0.8的有髓轴突(先前存在的有髓轴突)(图6a)(梅等人，2014年)。EAE组小鼠原有的有髓轴突密度(g-Ratio<0.8)显著降低，chrm1cko组和对照组eae组小鼠之间无明显差异，表明opc中chrm1缺失并不影响脱髓鞘的严重程度(图7m)。在对照ı小鼠中检测到有髓鞘轴突密度(g-ratio>0.8)，并且与NA EAE小鼠相比显著增加，这表明即使在对照EAE小鼠中，重新髓鞘形成也是一个持续的过程(图7n)。值得注意的是，与对照EAE小鼠相比，Chrm1CKO小鼠的有髓鞘轴突密度增加了两倍(图7n)，表明EAE中的再髓鞘确实具有神经保护作用，不受神经炎性环境的影响。此外，我们通过CD3和Iba1的免疫染色检测了T细胞、巨噬细胞的浸润和小胶质细胞的激活，并在EAE后期的Chrm1 cKO和对照仔鼠的脱髓鞘病变中定量了这些细胞的数量(图7-图补充1)。我们没有发现CD3或Iba1阳性细胞在Chrm1CKO和对照仔鼠皮损中的统计差异，这表明Chrm1CKO不会明显改变炎症反应(图7-图补充1)。虽然我们不能排除从OPC中删除Chrm1可能会改变OPC尚未确定的炎症作用的可能性，但我们的研究结果表明，最有可能的情况是，在炎性脱髓鞘后，重新髓鞘形成在维持轴突完整性方面发挥了因果作用。

讨论

轴突变性是多发性硬化症慢性残疾和进展的基础，目前无法治疗免疫调节途径在减少复发次数方面有效，可能会影响进行性残疾的发生时间，但不能完全阻止进展(Carrithers，2014；Rice，2014)。目前，还没有可用于神经保护的干预措施，特别是因为导致轴突变性的机制还不完全清楚(Bjartmar和Trapp，2003；Sherman和Brophy，2005；Wang等人，2012)。那么，我们怎样才能防止炎性脱髓鞘后的轴突变性呢？新出现的证据表明，髓鞘通过在发育中的中枢神经系统提供物理和代谢支持，对于确保轴突的存活非常重要(Hirrlinger和Nave，2014；Morrison等人，2013；Saab等人，2013)。由于重新髓鞘形成在多发性硬化症病变中是一个低效的过程，重新髓鞘形成疗法已被提出作为多发性硬化症的一种潜在的治疗方法(Franklin和Ffrch-Constant，2008)。为了促进髓鞘修复，最近的高通量筛选工作已经产生了一些髓鞘再生化合物(Deshmukh等人，2013年；Mei等人，2014年；Najm等人，2015年)，有趣的是，其中一些化合物能够减轻EAE的临床严重性(Deshmukh等人，2013年；Najm等人，2015年)。然而，我们对髓鞘再生的重要性的有限认识抑制了人们对髓鞘再生方法保护轴突和防止进展的热情，因为EAE临床症状的减轻也可能归因于非选择性药物治疗方法的免疫调节作用。在这里，我们利用一种遗传方法，通过特异性地操纵少突胶质细胞而不影响其他类型的细胞，即通过有条件地删除OPC中的Chrm1，来增强再髓鞘形成。我们的发现首次将EAE中的重新髓鞘形成与活动性炎症和轴突变性分开，并清楚地表明在炎性脱髓鞘条件下，重新髓鞘作用足以维持轴突的完整性和神经元功能。值得注意的是，内源性再髓鞘形成在EAE的高峰期几乎不存在，只有在后期才能观察到，这表明细胞自主再髓鞘形成在炎症环境中是一个低效的过程。值得注意的是，正如谱系追踪所证明的那样，髓鞘再生方法能够早在EAE高峰期就开始重新髓鞘形成，并足以拯救轴突免于退化，可能是通过重建对脱髓鞘轴突的代谢和/或物理支持。另外，我们假设有髓轴突被排除在MOG诱导的脱髓鞘之外，部分原因是未成熟的新形成的髓鞘中没有MOG的表达。这一点在检测到一些被薄的绿色荧光蛋白膜包围的轴突时很明显，这些轴突的MOG表达仍为阴性(图3c)。此外，尽管在重新髓鞘形成后观察到了稀薄的髓鞘，但这个过程似乎足以保存大量的轴突。这一证据表明，炎性脱髓鞘后早期髓鞘再分化可能是保护轴突完整性的有效干预措施。综上所述，我们的发现为炎性脱髓鞘后重新髓鞘形成作为保护轴突完整性和神经元功能的一种手段的功能作用提供了新的见解。我们的研究结果清楚地将OPC上的Chrm1确定为抗毒鼠碱治疗的再髓鞘治疗的靶点--表明再髓鞘治疗是恢复功能和延长MS患者生活质量的一种有前途的方法。

转基因小鼠

Chrm1、Chrm2、Chrm3、Chrm4、Chrm5和HRH1基因敲除小鼠(Noubade等人，2007年；Wess，2004年)。Chrm1-Chrm5基因敲除小鼠在C57BL/6遗传背景上回交至少10代。在Chrm1突变小鼠中，通过用PGK-新霉素抗性盒替换包含Chrm1蛋白的前54个氨基酸的翻译起始点和编码区域的基因组片段，Chrm1功能被取消(Gerber等人，2001年)。Chrm1+/-小鼠被杂交产生Chrm1缺失(Chrm1-/-)和野生型(Chrm1+/+)小鼠。Chrm1花小鼠由Susumu Tonegawa(Kamslawa)博士提供。这两个品系已在C57BL/6遗传背景下保持了10代以上。Chrm1CKO的育种策略是将Cnp-Cre；Chrm1fl/+与Chrm1fl/fl杂交，产生条件基因敲除纯合(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)、杂合(CNP-Cre；Chrm1fl/fl)和斜生对照(Chrm1fl/fl)。Cspg4-CreERT2小鼠(朱等人，2011年)由Anders Persson博士(加州大学旧金山分校)和Mapt-GFP记者(Hippenmeyer等人，2005年)小鼠由John Rubenstein博士(加州大学旧金山分校)提供。用聚合酶链反应(Pcr)分析所有小鼠的基因型。用合适的引物扩增尾部基因组DNA。所有在这项研究中接受检查的小鼠都是按照加州大学旧金山分校实验动物护理管理小组的批准进行处理的。

将他莫昔芬(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)以0.5 mg/ml溶于葵花籽油中，在MOG肽免疫前2天口服一剂(40ml)。

少突胶质前体细胞的纯化

OPC的免疫泛素纯化如前所述(Lee等人，2013年)。简而言之，OPC是从出生后7-9个大鼠或小鼠的大脑皮层中提纯出来的。组织培养皿与山羊抗小鼠IgG和IgM二抗(Jackson Laboratory，Cat：115-005-004)在50 mM Tris-HCl中孵育过夜，终浓度为10 mg ml~(-1)，pH 9.5。用RAN-2、GalC和O4的一抗冲洗培养皿，并在室温下孵育。将啮齿动物大脑半球切成小块，在37˚C下与木瓜蛋白酶(Worthington)分离，研磨后，将细胞悬浮在淘洗缓冲液中(0.2%牛血清白蛋白)，并在3个免疫平皿上依次孵育：用RAN-2和GalC进行阴性选择，然后用O4进行阳性选择。使用0.05%的胰蛋白酶(宾夕法尼亚州匹兹堡的Fisher Science)将OPC从最终的平底盘中释放出来。OPC在免疫泛滥后通常纯度为95%，存活率为94%。

免疫荧光

小鼠用1%戊巴比妥钠深度麻醉，用4%多聚甲醛在PBS中经心灌注。脑和脊髓在30%蔗糖中脱水，在冰冻切片机(HM450，Thermo)上切片(10 mm或20 mm)。盖玻片上培养的OPC用4%多聚甲醛固定在PBS中。自由漂浮切片或盖片切片用20%正常山羊血清封闭，与一抗在4˚C孵育过夜，切片在室温下与二抗孵育1小时。一次抗体包括：大鼠抗髓鞘碱性蛋白单克隆抗体(1：500，毫孔，猫：MAB395)，兔抗PDGFRA单克隆抗体(1：8000，由W.B.StallCup赠送)，山羊抗Chrm1(1：100；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-7470)，山羊抗Chrm3(1：100；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-31487)，山羊抗Chrm5(1：100；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-7470)，山羊抗Chrm5(1：100；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-7470)，山羊抗Chrm5(1：100；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-31487)；圣克鲁斯生物技术公司，猫：SC-7479)，鼠抗Chrm2单克隆(1：100，abcam，猫：ab90805)，鼠抗Chrm4(1：100，abcam，猫：ab77956)，山羊抗HRH1(1：100，Sigma，猫：SAB2501418)，鼠抗CGRP(1：10,000，abcam，猫：ab81887)，鼠抗CCH1(1：100，Sigma，猫：SAB2501418)。二次抗体包括：AlexaFluor-488-、AlexaFluor-568-或Cy5-偶联的兔、鼠或山羊二次抗体(1：500；Invitgen)。用DAPI(Vector Labs)鉴定细胞核。髓鞘染色：用氟髓鞘(1：500，Invitgen，Cat：F34651)在PBS中RT孵育20min。

用Trizol(Invitgen，Cat：15596026)从大鼠卵巢上皮细胞培养或大鼠皮质中提取核糖核酸(Invitgen，Cat：15596026)。使用RETROScript逆转录试剂盒(Life Technologies，Cat：AM1710)进行逆转录。如前所述进行PCR(Mei等人，2016年)。简而言之，利用基因聚合酶(Invitgen，Cat：10342-020)扩增目的基因。用看家基因3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)的检测引物和内控引物对每个cDNA样本进行分析。Forward and reverse primers used for expression analyses are as follows：Chrm1F(agcagcagctcagagaggtc)and Chrm1R(gggcatcttgatcaccactt)；Chrm2F(tcgctccgttatgaatctcc)and Chrm2R(tccacagtcctaacccctac)；Chrm3F(gtgccatcttgctagccttc)and Chrm3R(tcacactggcacaagaggag)；Chrm4F(gacggtgcctgataaccagt)and Chrm4R(ctcaggtcgatgcttgtgaa)；Chrm5F(acagagaagcgaaccaagga)and Chrm5R(ctcagccttttcccagtcag)；Hrh1F(gagcttcgggaagacaagtg)and Hrh1R(ttggcaccttccttggtatc)；and GAPDHF(aggccggtgctgagtatgtc)and GAPDHR(tgcctgcttcaccaccttct).

使用CFX96Touch qRT-PCR系统(Bio-Rad)进行qRT-PCR。用Trizol(Invitgen)从纯化的大鼠OPC培养液中提取RNA。用第一链cDNA合成试剂盒(PROMEGA)扩增cDNA。荧光染料SYBR Green(罗氏)被包括在每个检测中，以测量每个退火阶段的DNA浓度。用看家基因β-肌动蛋白(β-actin)的检测引物和内部对照引物对每个cDNA样本进行三重分析。将每个靶cDNA连续稀释10倍，绘制稀释曲线，估计目的cDNA的拷贝数。荧光强度与周期数相对应，并使用β-肌动蛋白进行归一化，以说明样品的可变性。用于表达分析的引物如下：Chrm1F(Atcaccacaggcctcctgtc)和Chrm1R(Aagattcatgacagaggcgttg)；Chrm2F(Accctctacactgtgattggcta)和Chrm2R(Ggcccagatgaaggaa)；Chrm3F(Agctggaagcccagtgc)和Chrm3R(gtagctt

用Zeiss Axio Imager Z1荧光显微镜或Zeiss LSM-700共聚焦显微镜采集少突胶质细胞及其共培养细胞的荧光图像，激发波长分别为Alexa Fluor 488(488 Nm)、596(568 Nm)、647(628 Nm)或DAPI(380 Nm)。为了进行统计分析，从每口井中随机采集了至少三个代表性区域(20倍)。使用Zen软件(Zeiss)和Image-Pro Plus软件5.0(Media Cybernetics，Silver Spring，MD，USA)进行检测和定量。

在电镜下，动物先用0.1M pH 7.4的醋酸钠冲洗，然后用1.25%的戊二醛和2%的多聚甲醛在0.1M的pH 7.4中灌流。然后，组织在格拉德斯通研究所(UCSF)的电子显微镜核心设施中进行处理。组织在相同缓冲液中后固定在2%四氧化二钐中，用2%醋酸铀酰封闭和染色，在丙酮中脱水，渗透并包埋在LX-112树脂(Ladd Research Industries，Burlington，VT)中。半薄切片甲苯胺蓝染色。样品在Reichert Ultracut S超微切片机上超薄切片，用0.8%柠檬酸铅反染色。在JEOL JEM-1230透射电子显微镜(JEOL USA，Inc.，Peabody，MA)上检查网格，并用Gatan超声波1000数码相机(Gatan Inc.，Warrendale，PA)拍摄。用Image-Pro Plus软件测量轴突直径与轴突直径与髓鞘轴突直径的比值，计算有髓纤维的G比值。在所有情况下，对三对小鼠的电子显微照片进行了测量。

脊髓切片用2%戊二醛0.1M PBS，pH7.2后处理1h。样品在PBS中漂洗，切片用0.1%的OsO4在PBS中RT孵育45min

OPC-DRG共培养物的制备如前所述(Mei等人，2014、2016)。简单地说，从E15 Sprague-Dawley大鼠分离、培养DRG神经元(每25 mm盖玻璃150,000个细胞)，并在含有100ngml-1 NGF(Abd Serotec)的胶原包被盖玻片上纯化。神经元维持3周，并在种植OPC之前广泛使用DMEM(Invitgen)清洗以去除任何残留的NGF。共培养物在DMEM(Invitgen)+B27(Invitgen)、N2(Invitgen)、青霉素-链霉素(Invitgen)、N-乙酰半胱氨酸(Sigma-Aldrich)和Forskolin(Sigma-Aldrich)的化学培养基中培养。

如前所述，在8周龄野生型和Chrm1缺失型仔鼠的脊髓背索和腹外侧白质区域诱导了脱髓鞘损伤(Chong et al.，2012)。简单地说，动物用异氟烷和丁丙诺啡麻醉，脊髓暴露在t12/13水平。0.5ml 1%溶血磷脂酰胆碱(l-a-溶血磷脂酰胆碱)。在每个病变部位用汉密尔顿针注射。注射4只野生型小鼠和4只Chrm1基因缺失小鼠，10dp.l后进行分析。

在8-10周龄的雌性C57BL/6小鼠(Jackson Lab，Cat：000664)皮下注射100 mg的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白多肽(氨基酸35-35；Auspep)，其中完全弗氏佐剂含2 mg/ml的灭活结核分枝杆菌H37RA(DIFCO)。200 ng百日咳毒素(LIST生物实验室公司)。MOG35-55诱发的EAE小鼠每天灌胃氯马斯汀10 mg/kg(PBS中含10%二甲基亚砜)或等体积的溶媒，分别于第0天和第2天腹腔注射氯马斯汀10 mg/kg(含10%二甲基亚砜的PBS)或等量的溶媒。对Chrm1KO或Chrm1CKO小鼠或C57BL/6遗传背景的野生型对照小鼠(C57BL/6)，用100 mg的少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽(氨基酸35~55；Auspep)和200 ng百日咳毒素免疫8~10周龄的雄性和雌性小鼠，在第0天和第2天诱导EAE。用33 mg重组小鼠MOG(RmMOG)蛋白免疫Cspg4-CreErt；Tau-GFP小鼠。每天给小鼠评分如下：0=无体征；0.5=尾巴远端无力；1=尾巴无力；1.5=背部翻转时不能立即转向；2=蹒跚行走；2.5=双侧后肢瘫痪；3=严重双侧后肢瘫痪伴一侧后肢瘫痪；3.5=双侧后肢瘫痪；4=开始前肢瘫痪；4.5=严重前肢瘫痪(动物被实施安乐死)；5=垂死

对EAE实验的临床数据进行统计分析，使用Mann-Whitney检验来检查个别日期。另外，使用双尾学生t检验来确定与对照培养物或对照小鼠(载体或野生型)相比，表示为*或#p<0.0 5，**或##p<0.0 1或*p<0.001的显著性。研究人员在EAE实验中对基因敲除小鼠的分配视而不见，直到最后的统计分析。