应用ELISA检测青海省部分地区羊衣原体和梭菌抗体

应用ELISA检测青海省部分地区羊衣原体和梭菌抗体

羊衣原体病是由鹦鹉热衣原体（Chlamydiapsittaci）引起的一种可在多种动物间广泛传播的人畜共患传染病，牛羊感染后可引起流产（妊娠后期）、早产、死胎及发热、肺炎、肠炎、多发性关节炎、脑脊髓炎和腹泻，种公羊发生睾丸炎等广泛性症候群[1]。在英国，羊衣原体流产占所有流产类疾病的比例约为 50%，年损失超过2 000万英镑，此外，衣原体病也是引起美国山羊流产的最常见病原[2]。在我国，对羊衣原体病的研究始于1978年，从那时起兰州兽医研究所的科研人员就对青海、西藏、内蒙、甘肃等地的羊流产病料进行了分离、鉴定和免疫学研究，调查发现这些地区山羊的流产率高达 20%～25%，而绵羊却很少发生流产[3-4]。随后，我国兽医工作者对国内部分地区羊衣原体病的流行状况陆续进行了调查研究。杨占魁等( 2006) 对青海省乌兰县改良绒山羊进行了衣原体病的血清学调查，结果阳性率达到14.73%[5]，何成基等(2010)对青海省海北州门源县、祁连县、刚察县和海晏县1223 份羊血清采用间接血凝试验进行检测，结果种公羊血清阳性率为6.18%，生产母羊血清阳性率为8.07%[6]；何存利等(2009)对宁夏各地区的16个规模化羊场进行衣原体病调查，发现羊场的阳性率为100%，羊群的平均阳性率为 19.3%[7]。由此可见，羊衣原体病在我国部分地区依然形势严峻，必须采取有效的措施进行防制。

羊的梭菌性疾病(clostridiosisi of sheep)是由梭状芽孢杆菌属(clostridium)的细菌所引起的一类可造成养羊业重大经济损失的急性传染病。这类疾病，具有发病急、病程短、死亡快、死亡率高、临床症状相似、生前诊断困难等特点[8]。羊的梭菌病是由梭菌属的几种主要致病性梭菌引起的羊的类急性传染病。由病败梭菌引起的叫“羊快疫”。D型魏氏梭菌引起的叫“羊肠毒血症”，也叫“软骨病”或“羊快疫”。C型魏氏梭菌引起的叫“羊猝狙”，B型魏氏梭菌引起的初生羔羊梭菌性痢疾，简称羔痢。绵羊、山羊、乳山羊均可感染。因本菌为土壤和污水中的常在菌，羊采食被其芽孢污染的饲料和饮食后，芽孢随之进入消化道，其中一部分被真胃中的胃酸杀死，一部分存活者进入肠道。当胃肠道正常的消化机能受到破坏，尤其是从干草改吃大量谷物或青嫩多汁富含蛋白质的草料后，瘤胃中正常分解纤维素的菌群失调，大量未消化的淀粉颗粒经真胃进入小肠，导致该菌迅速繁殖和产生大量的ε毒素和少量的α毒素。这些毒素进入血液，引起毒血症，使病羊发生休克而死亡。该病有明显的条件性和季节性。在牧区多发于春末夏初青草萌发和秋季牧草结籽后的一段时期；本病以"岁以内、营养良好、膘情较好的羊只多发和死亡较多。尼群、李秀英等分别从此病病原的调查、流行现状、诊治、防治措施等方面进行了研究，同时也得出大量关于此病的认识资料、防控措施。调查发现由于我省部分地区对羊梭菌性疾病疫苗接种情况比较好，所以发病率较低，趋于平缓，没有发生大的浮动，但由此可以看出我省羊梭菌病的存在，而且总体病死率较高[9]。目前，对于该病虽然有多种预防方法，但是任然在许多地方发生，对养羊业造成严重损失。

目前，用于检测羊衣原体和羊梭菌感染的方法很多，如电镜法、乳胶凝集试验、聚丙烯酰胺凝胶电泳法(PAGE)等，但因其各自的一些局限性，很难被广泛采用，自首次报道建立酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）以来，由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。尽管早期的ELISA由于特异性不够高而妨碍了其在实际中应用的步伐，但随着方法的不断改进、材料的不断更新，尤其是采用基因工程方法制备包被抗原，采用针对某一抗原表位的单克隆抗体动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分裂增殖形成效应B细胞进行阻断ELISA试验，都大大提高了ELISA的特异性，加之电脑化程度极高的ELISA检测仪的使用，使ELISA更为简便实用和标准化，从而使其成为最广泛应用的检测方法之一。

鉴此，为了解羊衣原体病和羊梭菌性疾病在我省的分布及流行情况，为今后制定防疫对策与措施提供一定的参考，在省内选择三个地区用ELISA检测方法进行羊衣原体病和羊梭菌性疾病的血清学调查。现将结果报告如下：

1.1 材料

1.1.1 样品

分别从青海天峻、海晏、海东地区采集羊的血液180份、180份、360份，共720份，以颈静脉采血，用常规方法分离血清，即将血液样本放在室温自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集血清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

1.1.2 ELISA检测试剂盒

   羊衣原体及羊梭菌检测试剂盒各4个，内含96孔包被反应板、标准品22.5ng/L、标准品稀释液、酶标试剂、样品稀释液、显色剂（A液、B液）、终止液、20倍浓缩洗涤液等。加样器200ul，100ul，50ul各1个；枪头若干；酶标仪、量筒、烧杯（注：监测过程中所应用到的量筒、烧杯等器皿，均经高压蒸汽灭菌器15磅20 min灭菌）。此次试验采用的试剂盒均购于兰州生物制品研究所，羊衣原体抗体检测试剂盒生产批号为：DGE93044。羊梭菌抗体试验试剂盒生产批号为：DGE903042。

1.1.3 洗液

取20mL酶标洗液(浓缩液)，加入到180 mL蒸馏水中，按1:10稀释。

1.1.4 主要仪器

微量加样器，微量振荡器，酶标仪，离心机等。

1.2 方法

1.2.1 编号

将样品对应微孔按序编号，每板应设阴性对照2孔，阳性对照2孔，空白对照1孔，空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同。

1.2.2 加样

分别在阴、阳性对照孔中加入阴性对照、阳性对照50ul。然后在待测样品孔先加样品稀释液40ul，然后再加待测样品10ul（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标包被板孔底部尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

1.2.3 温育

用封板模封板后置37℃温育30分钟。

1.2.4 配液

将30（48T的20倍）倍浓缩洗涤液加蒸馏水600ml后备用。

1.2.5 洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，如此复5 次，拍干。

1.2.6 加酶

每孔加酶标试剂50ul，空白孔除外。

1.2.7 温育

用封板模封板后置37℃温育30分钟。

1.2.8 洗涤

小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒弃去，如此重复5次，拍干。   

1.2.9 显色

每孔先加入显色剂A 50ul，在加入显色剂B 50ul，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。

1.2.10 终止

每孔加终止液50ul终止反应（此时蓝色立转黄色）。

1.2.11 测定

以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液15分钟以内进行。

1.2.12 结果判定

实验有效性：阳性对照孔平均值≥1.00，阴性对照孔平均值≤0.10

临界值（CUT OFF）计算：临界值=阴性对照孔平均值+0.5

阴性判定：样品OD值≤临界值（CUT OFF）鉴为羊衣原体抗体阴性或羊梭菌抗体阴性

阳性判定：样品OD值≥临界值（CUT OFF）鉴为羊衣原体抗体阳性或羊梭菌抗体阳性

本次检样共涉及全省3个地区，羊衣原体感染共检测血清样品720份，检出阳性样品43份，平均阳性率为5.83%。其中天峻检测的180份血清中阳性份有12份，阳性率达6.67%，阳性率为最高；海东地区检测的360份血清中阳性血清20份，阳性率为5.56%，阳性率为最低，具体结果见表1。羊梭菌感染共检测血清样品720份，检出阳性样品62份，平均阳性率为8.61%。其中海晏县检测的180份血清中阳性有份，阳性率高达12.22%，为被检地区中阳性率最高；在海东地区检测的360份血清中阳性数为24份，阳性率为6.67%，为三个地区最低，具体结果见表2。

表1青海省部分地区羊衣原体抗体阳性率统计表

表2青海省部分地区羊梭菌抗体阳性率统计表

3.1 目前对羊衣原体病及羊梭菌病的检测方法有很多报道[10]，本试验对羊衣原体病和羊梭菌性疾病的血清学调查采用酶联免疫分析法，原理是用双抗原夹心法测定样品中衣原体抗体水平。用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，以检测相应的抗体，使抗原与某种酶连接成酶标抗原，这种酶标抗原既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在测定时，把受检标本（测定其中的抗体）和酶标抗原按不同的步骤与固相载体表面的抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅来进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。

3.2 2009年青海省畜牧兽医科学院的史绍俊进行了德令哈市绒山羊衣原体病血清学调查,共检测德令哈市绒山羊血清100份,检出阳性26份,阳性率为26%[11]。2011年青海省刚察县畜牧兽医站的陈国林对刚察县藏羊血样 316 份进行检测，检出阳性 39 份，阳性率 12.34% [12]。2010年青海省海北州动物疫病预防控制中心的何成基、保善科等对采自海北四县的 1223 份羊血清，进行了衣原体病的血清学检测，结果共检出阳性羊血清 91 份，阳性率为 7.44% [13]。2011年青海省天峻县畜牧兽医工作站的张晓强、青海省天峻县阳康乡兽医站的李万财对天峻县自然放牧的藏羊群的316份藏羊血清，进行了衣原体病的血清学检测，结果共检出阳性羊血清29份，阳性率为9.18%[14]。本次应用ELISA对共和，青海天峻、海晏、海东地区的720份血清进行检查阳性率为5.83%，阳性率较以往略有下降，可能的原因有一是也许和青海的地理位置和气候有关；二是可能处于潜伏期或者是调查不是很广泛所致；三是我省大多为集约化养殖，在疾病防疫等方面有系统科学的方式方法，减少了各种疫病的发生。通过对羊衣原体病及其病原生物学特性的阐释流行病学的调查以及诊断方法的总结，现提出对该病进行综合防治的措施，为今后更好地控制该病的发生提供理论支持：一是加强饲养和管理水平，生产母羊在冬季适当补饲，绵羊和山羊分群养殖；二是加强山羊和绵羊衣原体病的流行病学调查，建立疫情监测制度，对疑似病例要及时检验，尤其对种公羊要加强检测，清除传染源; 此外要确定流行株及其生物学特征，为有效疫苗的研发和防制措施提供指导；三是抗生素治疗并不能根除该病，并且会诱导产生耐药菌株，以最好的办法是提高检测方法，使用有效疫苗；四是在衣原体病流行地区，应制定疫苗免疫计划，定期进行预防接种。

3.3 我国对于羊梭菌性疾病的研究早在80年代，对于其所包含具体病症、发病机理、流行特点、临床症状、病理变化、防治措施等有了一定的了解。在2011年新疆乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心王六合等对于他们在1999年和2006年参与诊治的二起绵羊和山羊梭菌型疾病引起的羊只死亡病例进行了研究并发表期刊，对羊梭菌性疾病的发病情况、流行特点、诊治情况等做了详细说明，最终结果为是由致病性梭菌引起的羊发病，其特点为病程短、死亡率高、以散发为主[15]；在我省2013年青海省动物疫病预防控制中心李秀英为了解本省羊梭菌病发病状态及菌苗应用效果情况，掌握疫病发生、死亡和流行规律组织在同仁、门源等7个县进行了羊梭菌病定点流行病学调查，完成了同仁、门源等7个县羊梭菌病定点流行病学调查工作并得出报告，报告指出发病时间为1~11月份，呈全年零星发病，发病羊以高原牧区散养为主，农区圈养羊极少发病[16]。我省各县动物防疫工作重点在重大动物疫病防控工作上，对羊梭菌病等地方流行病不够重视，把主要的工作精力放在了禽流感、口蹄疫等人畜共患病的防控上，通过全省梭菌病疫情上报情况分析，防控可从以下几个方面入手：一是应引起足够重视，加强对梭菌病的免疫，扩大检测范围；二是全面均衡加强防控工作；三是在防控上坚持预防为主，强化免疫效果；四是加强饲养管理，消除诱发因素，保持圈舍卫生清洁、干燥、保暖、通风；五是早确诊和治疗，防止羊群群体发病，造成经济损失。

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